紫外分光光度法★

    核酸，包括DNA和RNA，均由核糖、磷酸基以及堿基構成。其中，由于堿基含有芳香環(huán)結構，因此具有紫外吸收的特性。核酸的紫外吸收峰在260nm處，與此同時(shí)，還能通過(guò)計算A260/A280和A260/A230的數值，估計核酸的純度。（280 nm吸光通常來(lái)自蛋白質(zhì)，而230 nm則通常來(lái)自糖類(lèi)和苯酚等）。

    但是紫外分光光度法無(wú)法區分DNA和RNA，因為具有紫外吸收的結構是核酸的堿基，而DNA和RNA均含有堿基，因此當一份樣品同時(shí)含有DNA和RNA的時(shí)候，測定濃度會(huì )高于其真實(shí)濃度。

 熒光染料法 ★

    使用靶標特異性染料，該染料可以特異地與不同種類(lèi)的核酸鏈相結合，并在特定波長(cháng)光源的激發(fā)下，發(fā)出熒光。其中，結合了核酸的熒光染料，相比那些游離的，信號可增幅數十倍至數百倍，因此可以和背景區分開(kāi)來(lái)。在測量過(guò)程中，首先將待測DNA樣品與熒光染料混合，熒光染料會(huì )與DNA結合，形成熒光復合物。然后，將混合物放入Qubit測量?jì)x器中，儀器會(huì )通過(guò)激光激發(fā)熒光復合物，使其發(fā)出熒光信號。Qubit測量?jì)x器會(huì )根據熒光信號的強度自動(dòng)計算出DNA的濃度，基本是測序實(shí)驗室的標配儀器。

    目前，雙鏈和單鏈DNA、RNA及蛋白質(zhì)均有特異的熒光染料，無(wú)需專(zhuān)門(mén)純化樣品，或者在未知污染程度的情況下，使用Qubit可以方便地得知濃度信息。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法  ★

    qPCR法利用熒光檢測技術(shù)與PCR技術(shù)相結合，在PCR反應體系中加入熒光基團，通過(guò)實(shí)時(shí)監測整個(gè)PCR過(guò)程中熒光信號的變化情況，反映濃度的變化，*后通過(guò)已知濃度的標準曲線(xiàn)計算未知樣品的濃度，以達到準確定量文庫濃度。由于其特異性引物僅會(huì )定量?jì)啥私宇^連接完整的文庫，可排除單端或雙端都不連接接頭的不可測序文庫的干擾，因此qPCR法作為文庫定量的金標準，準確性**。

    文庫定量時(shí)，Qubit定的是樣本中所有核酸dsDNA的濃度（以dsDNA為例），包含未連接接頭的dsDNA片段，不能很好地體現出文庫中有效文庫的實(shí)際濃度，其結果一般不作為終濃度用于上機。而qPCR僅測定標準結構的文庫序列，非標準結構序列占比較大會(huì )導致Qubit測定值高于qPCR濃度值。