數字PCR (digital PCR, dPCR)是在普通PCR和定量PCR基礎上發(fā)展的第三代PCR技術(shù)，通過(guò)有限稀釋和泊松分布統計實(shí)現**的**定量檢測。相比于前兩代PCR技術(shù)，dPCR能夠實(shí)現DNA模板的**定量且對PCR抑制劑具有更強的耐受性。目前，該技術(shù)在致病菌和病毒、基因突變、甲基化DNA、轉基因成分和食品摻假的檢測中都得到了廣泛的應用。

PCR技術(shù)的發(fā)展

近年來(lái)，分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，尤其是基于PCR衍生出的一系列技術(shù)，因其具有操作簡(jiǎn)單、快速準確、特異性強且靈敏度高的特點(diǎn)，己被廣泛應用于各種檢測領(lǐng)域。1983年，美國KB Mullis教授發(fā)明了PCR技術(shù)用于核酸檢測，其被稱(chēng)為**代PCR。隨后PCR技術(shù)出現井噴式發(fā)展，1992年科學(xué)家們在**代PCR技術(shù)的基礎上引入熒光化學(xué)物質(zhì)，發(fā)明了定量PCR技術(shù)(quantitative PCR, qPCR)：通過(guò)熒光信號的變化對整個(gè)PCR過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監控，*后通過(guò)循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)和標準曲線(xiàn)對待測樣本進(jìn)行定量檢測。數字PCR (digital PCR, dPCR)技術(shù)是近年來(lái)廣泛應用于檢測的第三代PCR技術(shù)。區別于qPCR依賴(lài)校準曲線(xiàn)對靶基因定量的策略，該技術(shù)通過(guò)將PCR體系分散成無(wú)數個(gè)小體積的反應單元進(jìn)行擴增，允許單拷貝DNA的檢測，可以實(shí)現對核酸的**定量。每個(gè)小反應單元含有少量或者沒(méi)有目標序列，這有助于降低樣本中的多種抑制劑的干擾和PCR體系中模板之間的競爭效應。表1總結了三代PCR技術(shù)的特點(diǎn)及其應用范圍。

數字PCR的原理

dPCR的原理是通過(guò)有限稀釋將含有目的DNA的PCR反應體系分散成無(wú)數個(gè)單一模板的PCR體系進(jìn)行擴增，再通過(guò)統計檢測結果及泊松分布校正實(shí)現目的DNA的**定量(圖1)。

    dPCR包括三個(gè)步驟：分散體系、PCR擴增和信號檢測。通過(guò)樣品的稀釋和分散形成分散體系，這一步是限制dPCR發(fā)展應用的一個(gè)重要因素，其所引起的分散數量和分散體積的不同極大地影響著(zhù)定量結果的精度與準確性。分散體系的形成增加了靶分子的有效濃度，并在一定程度上對存在干擾的復雜化合物進(jìn)行了純化，提高了靶分子和背景之間的比率％?；赿PCR統計的定量方式，反應體系的分散數量越多，低濃度靶分子的檢測可能性就越大，檢測靈敏度就越高，同時(shí)多個(gè)單一的反應單元也為多目標序列的高通量檢測的發(fā)展提供了基礎。此外，分散體積的不同會(huì )對拷貝數結果的測量產(chǎn)生影響，是造成dPCR精度下降的一個(gè)潛在因素，且與檢測限的大小形成反比關(guān)系。

    目前己成功應用于商業(yè)化的dPCR系統根據分散方式的不同可分為三種主要類(lèi)型：基于油包水微滴生成技術(shù)的微滴式數字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)、基于微孔芯片的微孔板數字PCR (micro-chamber digital PCR, mdPCR)和基于微流控技術(shù)的微流控芯片式數字PCR (microfluidic chip digital PCR, mcdPCR)。另外，基于水凝膠珠、瓊脂糖珠和生物打印技術(shù)等樣本分散方式的dPCR雖然尚未商業(yè)化，但在現有的實(shí)驗研究中己取得一定進(jìn)展。微滴式通過(guò)油包裹PCR體系形成無(wú)數個(gè)油包水微滴，每個(gè)微滴是一個(gè)獨立的反應單元，這種特殊的微滴在進(jìn)行PCR時(shí)能夠保證完整的形態(tài)，不會(huì )互相擴散，也阻止PCR混合物液滴在熱擴增過(guò)程的蒸發(fā)；微孔芯片式是利用光刻技術(shù)在硅基上刻蝕出微孔陣列，再通過(guò)表面改性、打磨等操作形成數萬(wàn)個(gè)納升級的表面疏水和孔內壁親水的微反應室；微流控芯片式則是利用微流控芯片裝置使PCR反應體系準確快速地分散于芯片孔中，而每個(gè)孔都是一個(gè)小反應體系(納升級)。

雖然基于微流控技術(shù)的微滴生成方法已經(jīng)成熟，但是其技術(shù)本身帶來(lái)的高昂成本以及復雜的轉液手工操作使用戶(hù)苦不堪言。振動(dòng)注射技術(shù)的研發(fā)初衷就是要開(kāi)發(fā)出全自動(dòng)化，低成本，高可靠性的微滴生成方法。思納福（sniper）振動(dòng)注射技術(shù)的核心是一個(gè)特制的加樣槍頭。槍頭浸入油相中，水相反應液勻速排出槍頭，在進(jìn)入油相的過(guò)程中，槍頭前端進(jìn)行勻速的擺動(dòng)，從而產(chǎn)生均一的微液滴。采用振動(dòng)注射技術(shù)，一方面可以通過(guò)控制流速，振動(dòng)頻率來(lái)靈活調整微滴體積的大小，另一方面該方法可以直接整合到自動(dòng)化加樣工作站流程中，無(wú)需昂貴的微流控耗材，能夠直接在多孔板中生成微滴，在低成本的同時(shí)實(shí)現了液滴生成全流程的自動(dòng)化。同時(shí)，振動(dòng)注射技術(shù)對油相粘度不敏感，無(wú)需特殊的溫控環(huán)境就能夠產(chǎn)生均一可控的微滴。

 關(guān)于信號檢測，目前主要有光電倍增管(photomultiplier，PMT)、桂光電子計數器(multi-pixelphoton counter, MPPC)、電荷稱(chēng)合器件(charge-coupled device, CCD)、互補金屬氧化物半導體(complementary metal oxide semiconductor, CMOS)、掃描器等5種高分辨率的圖像處理策略。

    dPCR定量計數的方法相較于傳統qPCR的定量方法更為簡(jiǎn)單，無(wú)需建立標準曲線(xiàn)和計算反應的擴增效率等繁瑣步驟，而是通過(guò)直接計數的方式得出檢測結果。根據陽(yáng)性信號數量進(jìn)行統計計算時(shí)，所得的*終結果不是真實(shí)的目標DNA分子拷貝數存在著(zhù)一定的可能性，因此需要通過(guò)泊松分布概率公式對反應的結果進(jìn)行校正計算。

數字PCR在生物學(xué)檢測中的應用

dPCR發(fā)展至今己近20年，因其具有檢測靈敏度高、特異性強且有效避免PCR抑制劑的影響等優(yōu)勢，在分子檢測和疾病診斷等領(lǐng)域都得到了廣泛應用。尤其是近幾年隨著(zhù)dPCR儀器的不斷開(kāi)發(fā)，有大量的研究報道進(jìn)一步證實(shí)了dPCR的優(yōu)勢。

?致病菌的檢測

致病菌，是導致食源性疾病發(fā)生的主要原因。通過(guò)設計致病菌的靶基因序列的特異性引物和進(jìn)行擴增是應用PCR技術(shù)實(shí)現檢測的主要原理。dPCR作為第三代PCR技術(shù)，提高了檢測的靈敏度和準確性，減少了前期的增菌培養過(guò)程，大大縮短了檢測分析的時(shí)間，而且不需要建立標準曲線(xiàn)即可實(shí)現對目標分子的**定量檢測。

?病毒的檢測

目前病毒檢測常用的方法主要是通過(guò)免疫學(xué)方法檢測其蛋白質(zhì)或通過(guò)分子生物學(xué)方法檢測其特定核酸。dPCR作為**的分子生物學(xué)檢測技術(shù)，檢測時(shí)無(wú)需建立標準曲線(xiàn)且不受基質(zhì)效應的影響，適用于病毒分子定量檢測尤其是低拷貝病毒的定量檢測。

?基因突變的檢測

基因突變的檢測方法主要是PCR或Sanger測序法，但這兩種方法對低含量的基因突變檢測靈敏度低，且難以滿(mǎn)足早期突變篩查的需要。dPCR**次被闡述正是用于基因突變的檢測，結果顯示dPCR對基因突變的分析靈敏度高，且可以對復雜組織進(jìn)行檢測。

?甲基化DNA的檢測

有研究表明，啟動(dòng)子高甲基化與一些關(guān)鍵腫瘤抑制基因的沉默有關(guān)，并且這種甲基化通常發(fā)生在癌變的早期階段，所以甲基化DNA檢測被認為是癌癥檢測和診斷的重要手段。目前，甲基化DNA的檢測方法己有大量文獻報道，其中基于限制性核酸內切酶的一類(lèi)方法通常與PCR技術(shù)聯(lián)合使用，而dPCR作為**的PCR技術(shù)在甲基化DNA的檢測中也得到了廣泛應用。

?細胞及基因治療方向的應用

數字PCR在細胞及基因治療方向的應用包括病毒載體滴度（例如：被用于定量制品中慢病毒載體滴度、AAV載體滴度、腺病毒載體滴度等），基因轉導檢測（例如：用于測量整合到誘導多能干（iPS）細胞、CD34 +造血干細胞、T細胞中的逆轉錄病毒、慢病毒載體的拷貝數）及基因治療制品中污染物檢測等。

?轉基因作物及食品摻假成分的檢測

近年來(lái)，轉基因食品飽受爭議，準確靈敏的檢測方法對轉基因食品的監控尤為重要。GB/T19495系列標準將qPCR作為檢測轉基因作物的金標準，但是qPCR在檢測轉基因成分基質(zhì)復雜的作物時(shí)會(huì )造成偏差，使檢測的結果不準確，而且還容易對低濃度的轉基因樣品造成漏檢。而dPCR作為第三代PCR技術(shù)，由于其在低豐度檢測和強耐受抑制劑方面的優(yōu)勢，應用dPCR對轉基因作物進(jìn)行檢測也受到了廣泛的關(guān)注。

思納福醫療科技有限公司（Sniper）成立于2018年4月，以微液滴技術(shù)為根基，專(zhuān)注于下一代精細化分析醫療儀器的研發(fā)。團隊來(lái)自于北京大學(xué)，北京航空航天大學(xué)等知名高校和企業(yè)，曾從事高端科研設備的定制化服務(wù)，客戶(hù)覆蓋航天、核能、醫療、新材料等領(lǐng)域，積累了豐富的新技術(shù)工程化和量產(chǎn)化經(jīng)驗。團隊開(kāi)發(fā)了具有全球化自主知識產(chǎn)權的微滴生成方法——振動(dòng)注射技術(shù)（Vibrant Injection）

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